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ZEBRAFISH

Cómo se coordinan el ciclo celular y la apoptosis durante la Gastrulación del Pez cebra?

Cómo se coordinan el ciclo celular y la apoptosis  durante la Gastrulación del Pez cebra?

 Durante el desarrollo desde un cigoto unicelular a un organismo maduro, numerosas divisiones celulares y fenómenos de diferenciación tienen lugar. La diferenciación y la formación de los tejidos necesitan estar coordinados con el ciclo celular para garantizar una correcta ocupación espacio-temporal en el plan corporal.La gastrulación que es el proceso temprano del desarrollo que lleva a la formación de 3 capas embrionarias (ecto, meso y endodermo) involucra toda una serie de movimientos celulares.  En el  zebrafish, la gastrulación comienza con la internalización de los precursores del mesodermo y endodermo en la región dorsal del embrión, en el anillo marginal.  Existen varias teorías de cómo estas células penetran y comienzan a migrar debajo del epiblasto hacia el polo animal . Algunos sostienen que lo hacen individualmente  por delaminación, y otros que las células superficiales alrededor del anillo lo hacen por involución.

Numerosos estudios destinados a investigar la coordinación entre todos estos procesos, proponen sistemas para modular el ciclo celular en los estadíos tempranos y observar luego cómo se comporta el embrión durante las etapas sucesivas de desarrollo.  Entre estos modelos se encuentra el presentado en marzo 2009 por Xiaolin Liu y colaboradores, acceso en http://jcb.rupress.org/cgi/content/abstract/184/6/805 . Su modelo propone la manipulación del balance Geminina/Cdt1, produciendo cambios en el ciclo celular y por consiguiente también en los procesos apoptóticos que tienen lugar para modelar el embrión, produciendo también cambios en los niveles del Factor antiapoptótico nuclear kB (NF-kB). NF-kB se asocia con el promotor Snail1a y activa al represor transcripcional de su mismo nombre el cual juega un papel crucial en la delaminación y migración de las células del mesoendodermo, proponiendo un mecanismo molecular por el cual NF-kB y Snail1a se coordinan con el ciclo celular durante la gastrulación.

1) EL CICLO CELULAR ES MODULADO POR LA MANIPULACIÓN DEL BALANCE GEMININA / CDT1

Una vez que el ADN se comienza a replicar, el proceso debe ser inhibido durante el mismo ciclo celular para mantener la estabilidad genética del individuo. La Geminina se acumula en el núcleo desde la fase temprana S hasta el final de la mitosis y directamente se une a Cdt1, evitando que éste se una al MCM (complejo microcromosómico) previniendo así la resíntesis de ADN.La progresión en el ciclo celular es incompatible con ciertos tipos de conductas que se dan durante el desarrollo, como la migración, adhesión o cambios morfológicos. En su trabajo Xiaolin Liu y colaboradores ( marzo 2009) , establecieron un sistema para modelar el ciclo celular en la gastrulación manipulando el balance Geminina/Cdt1 en embriones de Zf.

Métodos: Aislamientos de cDNA para Geminina, Cdt1 y mrGem ( geminina resistente al MO) y mutagénesis de Geminina en diferentes aminoácidos.Morfolinos y m RNAs ( Geminina, Cdt1, MCM5, p65, p53, p21)

Resultados: En el estadío de blastodisco se observó una transcipción uniforme en los embriones de geminina, en tanto Cdt1 predominó en la zona dorsal, indicando que a ese nivel es mayor el número de mitosis. ( http://jcb.rupress.org/cgi/content/full/jcb.200806074/DC1) En los ejemplares inyectados con Gem MO, Cdt1 mRNA hubo un aumento de las mitosis, por el contrario en los que se produjo una sobre expresión de Gem o knockdown de Cdt1 , disminuyeron. Igual sucedió con los embriones inyectados con MCM5MO, se observó una disminución de las mitosis. Morfolino oligo contra p21, un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina mostró un aumento en las células proliferantes.

Todos estos resultados muestran que un adecuado balance entre geminina y Cdt1 es crítico para la regulación del ciclo celular, ya que la manipulación del mismo en más o en menos produce variaciones importantes en la gastrulación de los embriones.

 2) LA MODULACIÓN DEL CICLO CELULAR PRODUCE DEFECTOS EN LOS MOVIMIENTOS CELULARES DE DELAMINACIÓN

 Para agendar los efectos en la modulación del ciclo celular en la gastrulación del Zf, se observaron los fenotipos tratados con Gem MO en estadíos avanzados y se realizaron co-transplantes a aceptores wild type para indagar en profundidad los efectos de la modulación del ciclo en los movimientos mesoendodérmicos.

Métodos: Inyección de Gem MO y observación de fenotipos al final de la gastrulación. Expresión de Goosecoid (gsc) como marcador de la placa precordal. Ensayo de co-transplante de células de la placa mesodérmica precordal contro y con ciclo modulado a embriones aceptores en etapa de escudo de tipo salvaje.

Resultados: Se observa una disminución ántero-posterior del eje corporal con la inyección de Gem MO, lo que sugiere defectos en el movimiento del mesoendodermo. Para la expresión de gsc, se observó al 80% de la epibolia un retraso en la expresión cuando los ejemplares fueron inyectados con Gem MO y Cdt1mRNA.En el ensayo de co-transplante se dedujo que, el knockdown the Geminina llevaba a un retraso en la migración de las células y esto era revertido entre otras cosas por Snail1a.

Se concluyó entonces, que la delaminación que es el primer paso en la gastrulación y en los movimientos celulares durante la misma, está influenciada por las modulaciones del ciclo celular.

3) EL CICLO CELULAR COORDINA LOS MOVIMIENTOS CELULARES MESOENDODERMICOS A TRAVES DE LA APOPTOSIS, NF-Kb Y SU BLANCO DIRECTO, SNAIL1a.

 La apoptosis juega un papel crucial en el moldeado del embrión durante la gastrulación, y está debidamente equilibrada con el ciclo celular. Se quiso investigar el mecanismo a través del cual el ciclo celular coordinaba los movimientos durante la gastrulación con la apoptosis en embriones con modulación de su ciclo.

 Métodos: Ensayo TUNEL .Ensayo CAT. Ensayo ChIP

Resultados: Los niveles de apoptosis se correlacionan con el ciclo celular, y son dependientes de p53. P65 es un importante factor antiapoptótico en la gastrulación de los embriones de ZF.Al analizar el nivel nuclear de NF-kB se observó que es correlativo con el nivel de apoptosis en los embriones gastrulando.

La modulación del ciclo celular resulta en niveles anormales de la forma activa de NF-kB , y éste es el activador directo de Snail1a, lo que lleva a cambios en los movimientos celulares.

 4) COORDINACION ENTRE EL CICLO CELULAR Y LOS MOVIMIENTOS MESOENDODÉRMICOS SE REQUIERE PARA UNA CORRECTA DISTRIBUCIÓN DE LOS PRECURSORES CELULARES

 La gastrulación lleva a la formación de las 3 capas germinales. Después de la delaminación y la subsecuente migración , el hipoblasto contribuye a la configuración de dos capas: meso y endodermo.Defectos en la delaminación produce efectos en la formación de estas capas.Se observó la distribución del mesoendodermo con diferentes marcadores.

 Métodos: Ensayo Casanova ( codifica una proteína relacionada con Sox). Expresión de no tail.

Resultados: Durante la gastrulación , el ciclo celular coordina la distribución de las células endodérmicas mediante apoptosis, NF-kB y Snail1a.

5) LOS DEFECTOS EN LA DISTRIBUCIÓN DE LAS CÉLULAS ENDODÉRMICAS CAUSADAS POR MODULACIÓN DEL CICLO CELULAR PRODUCE DEFECTOS EN LA INDUCCIÓN NEURAL.

La inducción neural está conectada al tejido endodérmico durante la gastrulación. Estudios previos reportaron que en Xenopus la sobreexpresión de geminina inducía al tejido neural a producirse de forma ectópica (Kroll et al.,1998). Se vio que la expresión de Otx2 y Sox2, estaba dispersa en embriones inyectados con Gem MO , lo que era parcialmente rescatada por la inyección de Snail1a mRNA. Para investigar si esta inducción neural atípica era secundaria a un defecto en la distribución del endodermo o no, se realizaron ensayos de transplante.

 Método: Ensayo Casanova en embriones cas mutantes.

 Resultado: Se recuperó la expresión de los marcadores neurales, tanto al 90% de la epibolia como hasta el estadío de 14 somites, aún en la ausencia de geminina en el ectodermo.

 Esto indica que los defectos en la distribución de las células endodérmicas causados por la modulación en el ciclo lleva secundariamente a defectos en la inducción neural.

 CONCLUSIONES

En el estudio que revisamos ( Xiaolin Liu et al,2009) se propone un sistema para manipular el ciclo celular  en embriones tempranos de Zf, basado en el balance Geminina/Cdt1. Cambios estables en distintos niveles de la gastrulación ( escudo, 70%, 90% epibolia), indican la habilidad para manipular en positivo o negativo el ciclo celular de los embriones durante la gastrulación. Se concluye además que hay cambios recíprocos entre el número de apoptosis y el nivel de mitosis en las células activas. Estos cambios deberían variar luego de la gastrulación. Los resultados obtenidos muestran un aumento general en el estadío de 18 somites de la apoptosis en los ejemplares, ya sea inyectados con Gem MO o Cdt1MO, o geminina mRNA o Cdt1 mRNA. El autor plantea dos posibles razones para esto, ya sea que al modularse el ciclo y los movimientos gastrulatorios con su consiguiente variación de formación de las capas, aumenta el proceso apoptótico como regulador de la integridad general de los embriones. O que , alternativamente, la coordinación molecular entre el ciclo celular, la apoptosis y los movimientos celulares llegado un momento del desarrollo, cambia a otros mecanismos  regulatorio, perdiendo coordinación. La apoptosis se observa solamente después de la gastrulación en la mayoría de los vertebrados. Sin embargo un nivel adecuado de la misma  , junto con una maquinaria antiapoptótica que incluye en este caso a NF-kB y a Snail1a que es su blanco corriente abajo, es necesario para la coordinación entre el ciclo celular y los movimientos mesoendodermales. Se han hecho reportes previos de que Snail1a se expresa en la zona marginal que es la región de delaminación , y en la capa sincitial vitelínica (YSL), pero no en las células que mesoendodérmicas que migran. En este estudio se vio que Snail1a, es capaz autonómicamente de rescatar los movimientos defectuosos causados por la modulación del ciclo. Esto sugeriría que estas variaciones harían expresarlo en zonas que normalmente aparece.

 En resumen, los investigadores proponen que la progresión en el ciclo celular , lo cual coincide con un nivel adecuado de apoptosis y de un contrabalance antiapoptótico ( el que involucra a NF-kB y a Snail1a) son críticos para la delaminación de las células del mesoendodermo y para la coordinación de sus movimientos durante la gastrulación.

 

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